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本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测蜂蜜、动物组织(鸡肉、猪肉、鱼、虾)、牛奶、奶粉和鸡蛋等样本中的环丙沙星(CPFX)。


试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的环丙沙星和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗环丙沙星抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含环丙沙星含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中环丙沙星的残留量。


环丙沙星是一种喹诺酮类抗菌药，因其具有广谱抗菌活性和很强的组织穿透能力，因而成为畜禽和水产的专用喹诺酮类抗菌药物，被大量用于治疗、预防和促进生长。但由于其耐药性和潜在的致癌性，欧盟、日本及我国均制定了在组织中的最高残留限量。

• 灵敏度：0.1ppb(ng/ml)
  
• 检测下限：
  

  组织	蜂蜜	牛奶	奶粉	鸡蛋
  0.3ppb	0.3ppb	2ppb	5ppb	3ppb

• 交叉反应率：
  

  环丙沙星	噁喹酸	左氧氟沙星	洛美沙星	麻保沙星	沙拉沙星
  100%	28%	10%	4%	4%	2%

• 样本回收率：85%±15%(组织、蜂蜜、牛奶、奶粉、鸡蛋)

组分	规格
酶标板	96孔
标准液(0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ppb)	6×1mL
100ppb高标准液	1mL
酶标记物	5.5mL
抗体工作液	5.5mL
底物液A	6mL
底物液B	6mL
终止液	6mL
20×浓缩洗涤液	40mL
5×复溶液	50mL

保存：4℃，切勿冷冻，有效期1年。

• 仪器：酶标仪、打印机、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平(感量0.01g)。
  
• 微量移液器：单道20μL～200μL,100μL～1000μL、多道300μL。
  
• 试剂：无水乙腈、正己烷、浓HCl。

• 室温低于25℃或试剂及样本没回到室温(25℃)会导致所有标准OD值偏低。
  
• 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
  
• 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。
  
• 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。
  
• 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
  
• 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位(A450nm＜0.5)时，表示试剂可能变质。
  
• 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。

• 配液1：0.15M盐酸溶液
  取5mL浓盐酸，加入去离子水中定容到400mL。
  
• 配液2：样本提取液
  量取10mL 0.15M盐酸溶液(配液1)加入到90mL无水乙腈中混合均匀。
  
• 配液3：复溶液
  将5×复溶液用去离子水5倍稀释(1份复溶液加4份去离子水)，用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。
  
• 配液4：工作洗涤液
  将浓缩洗涤液20倍稀释(1份洗涤液加19份去离子水)。

• 动物组织(鸡肉、猪肉、鱼、虾)：
  样本稀释倍数：2，检测下限：0.3ppb
  
  • 称2.0±0.05g均质过的组织样本于50mL离心管中；
    
  • 加入8mL样本提取液(配液2)，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
    
  • 取2mL清澈上层有机相至洁净干燥的10mL玻璃试管中，50～60℃水浴氮气吹干；
    
  • 加入1mL正己烷，振荡2分钟，再加1mL复溶液(配液3)，振荡30秒，室温4000转/分离心5分钟；
    
  • 去除上层正己烷，取下层水相50μL液体用于分析。
• 蜂蜜：
  样本稀释倍数：2，检测下限：0.3ppb
  
  • 取1.0±0.05g蜂蜜至50mL聚苯乙烯离心管中，加6mL样本提取液(配液2)，振荡5分钟，使其充分溶解；
  • 加入3mL复溶液(配液3)，加入11mL二氯甲烷，振荡5分钟，室温4000转/分，离心5分钟；
    
  • 吸去上层，取下层有机相8mL至干燥溶器中，50～60℃水浴氮气吹干；
    
  • 用1mL复溶液溶解干燥的残留物，再加入正己烷1mL混合30秒，室温3000转/分以上，离心5分钟；
    
  • 去除上层取下层50μL液体用于分析。
• 牛奶：
  样本稀释倍数：20，检测下限：2ppb
  
  • 取25μL样本液与475μL复溶液(配液3)混合，振荡1分钟，使其充分溶解；
    
  • 取50μL液体用于分析。
• 奶粉：
  样本稀释倍数：50，检测下限：5ppb
  
  • 称取0.5±0.02g均质物至10mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL去离子水，振荡，使其充分溶解；
    
  • 取100μL样本液与400μL复溶液(配液3)混合，振荡1分钟；
    
  • 取50μL液体用于分析。
• 鸡蛋：
  样本稀释倍数：30，检测下限：3ppb
  
  • 称取1.0±0.02g均质物至10mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL去离子水，振荡，使其充分溶解；
    
  • 取100μL样本液与400μL复溶液(配液3)混合，振荡1分钟；
    
  • 取50μL液体用于分析。

将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2～8℃。

• 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
  
• 加样反应：加标准品或样本50μL/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50μL/孔，再加入50μL/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应45分钟。
  
• 洗涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用工作洗涤液350μL/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净枪头的刺破)。
  
• 显色：每孔加入底物液A 50μL，再加底物液B 50μL，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟(若蓝色过浅，可适当延长反应时间)。
  
• 终止：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，终止反应。
  
• 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值(建议用双波长450/630nm)。测定应在终止反应后10分钟内完成。

• 百分吸光率的计算
  标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准液(0ppb)的吸光度值，再乘以100%，即
  

  百分吸光度值(%)＝	A	×100%
  	A0

  A：标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，A0：0ppb标准溶液的平均吸光度值
  
• 标准曲线的绘制与计算
  以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度(ppb)的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

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